流式細胞術(shù)的基本理論

1. 工作原理 流式細胞儀主要由流動室及液流系統(tǒng)、激光器及光學系統(tǒng)、光電管及檢測系統(tǒng)、計算機及分析系統(tǒng)四個部分組成，見圖18-1。

待測細胞被制備成單細胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后置于樣品管中，在氣體壓力推動下被壓入流動室，流動室內(nèi)充滿鞘液（不含細胞或微粒的緩沖液），在高壓作用下從鞘液管噴出包裹細胞，使細胞排成單列形成細胞液柱，依次通過檢測區(qū)。液柱與高度聚焦的激光束垂直相交，被熒光染料染色的細胞受到激光激發(fā)產(chǎn)生熒光信號和散射光信號，這些光信號通過波長選擇的濾光片，由相應(yīng)的光電管和電子檢測器接收并轉(zhuǎn)換成電信號，經(jīng)放大器放大后送入計算機并進行分析顯示和結(jié)果輸出。

帶有細胞分選功能的流式細胞儀對細胞的分選是由分選器來完成。待分選的細胞在形成液滴時被充以特定的電荷，并通過超高頻的壓電晶體產(chǎn)生高頻振蕩，使液柱斷裂成均勻的液滴，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場時，按照所帶電荷發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入的收集器內(nèi)，完成分類收集的目的。

2. 光學原理　流式細胞儀的光學系統(tǒng)由激光器和若干組透鏡、濾光片等光學元件及光學通路組成，細胞帶有的特異熒光染色經(jīng)激光器的激發(fā)，通過不同的光學元件將不同波長的熒光信號送入到相應(yīng)的電子探測器。

流式細胞儀的激光器以氬離子激光器常見，光學元件主要是分色反射鏡（DL）和濾光片（Filter），它們主要分為三類：長通濾片（long-pass filter，LP）、短通濾片（short-pass filter，SP）和帶通濾片（band- pass filter，BP）。

（1） 分色反射鏡（488DL、 550DL、 600DL、640DL）：用于選擇被測熒光波長，只允許大于特定波長的光通過，而將小于特定波長的光反射到光電檢測器。

（2） 長通濾片：只允許特定波長以上的光通過，特定波長以下的光不能通過。如LP620nm濾片，只允許620nm以上的光通過，而620nm以下的光被吸收或返回。

（3） 短通濾片：與長通濾片相反，允許特定波長以下的光通過，而特定波長以上的光被吸收或返回。

（4） 帶通濾片（488BP、525BP、575BP、675BP）： 允許某一特定波長的光線通過，而其他波長的光全部被阻斷。

例如，F(xiàn)ITC染料發(fā)射出525nm的綠色熒光，PE染料發(fā)射出575nm的橙色熒光，分別選擇550DL和525BP組成的濾片組和600DL和575BP濾片組，即可達到特異地接收FITC和PE熒光信號的目的。光電倍增管和硅光電二極管，可分別將側(cè)向散射光和前向散射光以及525～675等不同的熒光信號收集檢測。

3. 參數(shù)測量　流式細胞儀可同時進行多參數(shù)測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。

（1）散射光測量：細胞在通過測量區(qū)時由于受光照射會向空間360°立體角的所有方向散射光線，散射的信號與細胞的大小、形狀、質(zhì)膜和細胞內(nèi)部的折射率有關(guān)，與收集散射光的方向也有關(guān)。在流式細胞術(shù)中一般采用0°前向散射光（forward scatter, FS）和90°側(cè)向散射光（side scatter，SS）。前向散射光的強度與細胞大小有關(guān)，對于同一個細胞群體，散射光強的細胞大一些；而散射光弱的細胞小一些。側(cè)向散射光對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，對胞質(zhì)內(nèi)較大的顆粒也有反應(yīng)，可獲得有關(guān)細胞內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)及膜表面光滑程度的有關(guān)信息。圖18-2是利用流式細胞儀前向散射光和側(cè)向散射光測得的全血白細胞二維點圖，由圖中可見，利用FS和SS可將白細胞群中不同細胞群分開，得到很清楚的三群細胞。

（2）熒光測量：熒光信號主要包括兩部分：①自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光。細胞成分中能夠產(chǎn)生的自發(fā)熒光的分子（例核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強；培養(yǎng)細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發(fā)熒光越強。②特征熒光，即由細胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光。用流式細胞儀測定細胞的特征熒光時，自發(fā)熒光對所測定特征熒光是一種本底信號，應(yīng)設(shè)定陰性對照樣品加以去除，同時應(yīng)盡可能地通過選用較亮的熒光染料染色細胞、選用適宜的激光和濾片光學系統(tǒng)、采用電子補償電路等方法提高信號/噪聲比，以減少自發(fā)熒光的干擾，這是在樣品處理與測量中應(yīng)特別注意的問題。

熒光補償：對于雙標記或三標記熒光染色的樣品，在應(yīng)用FCM測量時需要對熒光信號的光譜重疊部分進行校正，特別是在實際測量中當兩波長比較接近，如FITC發(fā)射的525nm熒光和PE發(fā)射的575nm熒光會發(fā)生交叉干擾，而使被測信號失真，測量結(jié)果產(chǎn)生較大的誤差，因此需采用熒光補償方法來解決這種交叉重疊的問題。目前生產(chǎn)廠家都提供有熒光補償?shù)膶嵱贸绦?，用廠商的488nm激光激發(fā)的三種熒光染料（FITC、PE、PerCP），在測量中加以正確補償即可比較容易達到正確測量熒光信號的目的。

4. 測量參數(shù)分析　流式細胞儀的數(shù)據(jù)顯示方式包括單參數(shù)直方圖（histogram）、二維點圖（dot plot）、二維等高圖（contour）、假三維圖（pseudo 3D）等。

（1）單參數(shù)直方圖：是流式細胞術(shù)使用zui多的一種分析方法，它主要用來分析細胞相對數(shù)與測量參數(shù)之間的關(guān)系（圖18-3）。只能顯示一個參數(shù)與細胞之間的關(guān)系是它的局限性。

（2）二維點圖：二維點圖能夠顯示兩個獨立參數(shù)與細胞相對數(shù)之間的關(guān)系。橫坐標和縱坐標分別為與細胞有關(guān)的兩個獨立參數(shù)，平面上每一個點表示同時具有相應(yīng)坐標值的細胞存在。但對細胞點密集的地方就難于顯示它的精細結(jié)構(gòu)（圖18-4）。

（3）等高線圖和密度圖：可以同時表達檢測參量和細胞頻度，等高線圖是將代表相同細胞數(shù)目的點依次連接起來形成密閉的曲線，越在里面的曲線代表的細胞數(shù)目越多（圖18-5）；密度圖則依據(jù)細胞分布的密度大小，細胞密度大的地方點的密度大，使數(shù)據(jù)的顯示更直觀。

（4）假三維圖：利用計算機技術(shù)將原二維圖中的隱坐標-細胞數(shù)同時顯現(xiàn)，能多方位地觀察“山峰”和“谷地”的結(jié)構(gòu)和細節(jié)，更為直觀，有助于對數(shù)據(jù)進行分析。

5. 使用流式細胞儀注意事項

（1）光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件，暴露于較強的光線下以后，需要較長時間的“暗適應(yīng)”以消除或降低部分暗電流本底才能工作；另外還要注意磁屏蔽。

（2）使用光源必須預(yù)熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常，光源不得在短時間內(nèi)（一般1h左右）反復(fù)開關(guān)。

（3）液流系統(tǒng)必須隨時保持液流暢通，避免氣泡栓塞，所使用的鞘液使用前要經(jīng)過過濾、消毒。

（4）注意根據(jù)測量對象的變換選用合適的濾片系統(tǒng)、放大器的類型等。

（5）每次測量都需要設(shè)立對照組。