細胞培養(yǎng)基本技術(shù)概述

無菌操作基本技術(shù)
1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %
ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實驗操作。每
次操作只處理一株細胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細胞間
污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間
隔應(yīng)讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。
2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可
以暫時放置，其它實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦
拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操
作。
3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打
開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，
盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒
感染之細胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少Class II)。操作過程
中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心****，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳
針頭之傷害等。
5. 定期檢測下列項目：
5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力
5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。
5.3. 無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300
小時/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。
一、技術(shù)信息：細胞和培養(yǎng)液
貯存要求：
細胞：
貨一到，即刻做好培養(yǎng)前準備，如開好水浴，保持37℃，再從干冰中取出細胞株，放入水浴中，不停的搖動直到細胞株*解凍。在無菌的工作臺里，把解凍好的細胞株用灑精棉球擦凍存管的外殼，預(yù)防操作污染。然后把細胞株和自帶液體，平均移到兩瓶裝有15ml—20ml的培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶里面（不需要做細胞株離心，這種損害遠比二甲基亞砜更大）。
注意：整個操作流程均遵守無菌操作。
培養(yǎng)液：
把Clonetics細胞培養(yǎng)液貯藏在4℃的冰箱中。使用培養(yǎng)液時，需在無菌的條件下，取出您需要的量，然后把瓶子放回冰箱中。在使用前，務(wù)必使培養(yǎng)液恢復(fù)室溫。
補充物和試劑
如果您計劃在三天內(nèi)次培養(yǎng)，貯存所有的生長補充物——HEPES緩沖鹽溶液和4℃下的*中性溶液。Trypsin/EDTA溶液在4℃下貯藏壽命有限。貨一到，如果Trypsin/EDTA溶液解凍，立刻分成部分并再次使之冷凍到-20℃；如果Trypsin/EDTA溶液凍結(jié)，貯藏在-20℃條件下。如果您不打算在三天內(nèi)進行細胞培養(yǎng)，把所有的生長補充物和次培養(yǎng)試劑貯藏在-20℃的冰柜中。
Clonetics細胞的安全預(yù)防
•為預(yù)防污染，在處理來自人體的細胞產(chǎn)品時請遵照來自J.的組織培養(yǎng)方法——“Guidelines to Avoid Personnel Contamination By Infective Agents in Research Laboratories That Use Human Tissues”——概括的所有程序。
•用這些材料時，務(wù)必戴上手套和安全鏡。用冷凍細胞時，要小心操作；快速的溫度變化可能會導(dǎo)致液氮的飛濺。
•在進行操作以前，要對手進行*地清洗。
•在細胞或試劑操作的區(qū)域，不要吸煙，吃飯，喝酒。
•決不能用嘴吹移液管。
•來自人體和動物的產(chǎn)品都有潛在的生物危險性。盡管人體細胞系在PCR檢測中對HIV-1、乙肝和丙肝為陰性，還是有必要采取適當?shù)念A(yù)防措施以避免疏忽的暴露。
準備培養(yǎng)液
在無菌條件下按以下步驟操作
對一瓶*是補充液的培養(yǎng)液，操作如下：
1． 如需要，加BBE或BPE于500ml的基本培養(yǎng)液中。
a. 把BBE或BPE補充物從培養(yǎng)瓶中分離
b. 用乙醇或異丙醇清洗小瓶和培養(yǎng)瓶
c. 用移液管把瓶中所有的內(nèi)容物（大約2ml）放入培養(yǎng)基中。用培養(yǎng)基沖洗裝BBE的小瓶并用移液管把培養(yǎng)基移回到500ml的瓶中。
d. 蓋上蓋子，輕輕地旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)液幾次使之混合。
e. 記上BBE或BPE加入到培養(yǎng)液時的日期。
對BulletKits®，遵循以下步驟：
1. 用乙醇或異丙醇清洗SingleQuots®冷凍管外表面和基本培養(yǎng)瓶。
2. 無菌條件下打開冷凍管，用移液管把冷凍管中所有的液體移入到基本培養(yǎng)液中。
3. 用培養(yǎng)液清洗冷凍管。冷凍管中的液體不可能*移入到培養(yǎng)液中。小的損失，即使達到10%不會影響補充培養(yǎng)液的細胞生長特性。
4. 把試劑盒提供的標簽轉(zhuǎn)移到裝有補充液的基本培養(yǎng)瓶上。用它記錄日期和每次加入的補充物的量。我們建議您把*標簽貼在基本培養(yǎng)液標簽上，這樣可避免雙倍的添加和混淆。
5. 根據(jù)貯藏壽命在標簽上寫上有效期。*重新組裝的BulletKits有效期30天。這種補充培養(yǎng)液現(xiàn)在被用作生長培養(yǎng)液。
開始之前
在你準備培養(yǎng)液和細胞以前，請遵循以下步驟：
1． 預(yù)備一個無菌的環(huán)境
無菌的環(huán)境包括*，前面有個敞開的入口和透過性流線式通口或一個等同的裝置。
2． 決定所需培養(yǎng)液的量
參看一般塑料器皿的生長面積表以此來決定要用的培養(yǎng)液的量。
3.需用的無菌儀器和試管
•無菌可隨意使用的血清學上使用的移液管
•微型移液管和無菌移液尖
•可調(diào)節(jié)的多孔道的移液管和可重復(fù)使用的移液管
•盛裝多孔道移液管的無菌貯藏盒
•15ml無菌離心管
•細胞培養(yǎng)瓶
•多孔平底的組織培養(yǎng)板
•血球計或細胞計數(shù)器
4.其他需求的試劑：
•70%酒精（乙醇或異丙醇）
•生長培養(yǎng)液（特定細胞株）
•保護性手套和外罩
•臺盼藍
5． 為zui初的實驗草案計劃和準備
要依據(jù)伴隨有產(chǎn)品的分析證書上標明的細胞數(shù)。
6． 要核對培養(yǎng)箱中的濕度刻度。培養(yǎng)箱應(yīng)保持潮濕和37℃，裝有5%CO2和95%空氣。
培養(yǎng)已定的貼壁細胞株
這些說明不適用于RHNP,hNHEPS®,rtNHEPS,smNHEPSTM,NHDC,HPBMC和生血的干細胞。
1．計算要用的器皿的個數(shù)。參看分析證書，決定你試管中需要的確切的細胞數(shù)。參看6.3頁的“普通塑料器皿的生長面積”表有助于調(diào)節(jié)這種計數(shù)。
如果種植密度為2500細胞/cm2、3500細胞/cm2或5000細胞/cm2
請遵循以下計數(shù)法來算出所需器皿的個數(shù)。
(可裝的細胞數(shù)х百分存活率)/建議的細胞密度=能種植的zui多細胞數(shù)/cm2
能種植的zui多細胞數(shù)/平方厘米/試管有效生長面積=需準備的zui多試管數(shù)
用多個T-25試管而不用一個等量的相對大的試管的優(yōu)點，就是減少了一下子失去大量細胞的冒險性。也就是說，如果一個T-25試管*化有問題，還有其他的T-25試管可用。
2． 試劑瓶上貼上標簽，標明代數(shù)、細胞類型、分開的數(shù)目和日期。
3． 在無菌條件下，小心地打開裝有生長培養(yǎng)液的補充培養(yǎng)瓶，按每5cm2表面加1升生長培養(yǎng)液的標準，無菌的把培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)液中。
4． 請擰松試劑蓋。如果用的不是可松動的瓶蓋，擰緊瓶蓋，然后擰松到1/2圈。讓培養(yǎng)試管在37℃潮濕和裝有5%CO2的培養(yǎng)箱中溫育平衡至少30分鐘。
解凍貼壁細胞株
無菌條件下把定量的培養(yǎng)液加入試劑瓶中，并放入5%CO2和37℃的培養(yǎng)箱中平衡30分鐘。
1. 解凍以前準備一個小型移液管。
2. 從倉庫中取出冷凍細胞管。在打開以前，用乙醇或異丙醇清洗冷凍管。無菌條件下，暫時旋轉(zhuǎn)瓶帽1/4圈以減輕內(nèi)部壓力，然后再旋緊。不要一下子打開冷凍瓶。
3. 拿著冷凍管，把冷凍管的3/4底部浸泡入37的水浴中并輕輕旋轉(zhuǎn)1-2分鐘直到內(nèi)容物解凍為止。湊近看冷凍管，當zui后一條冰塊融化時，移走它。禁止把冷凍管*浸泡于水中。解凍細胞超過3分鐘會達不到理想的效果。
4. 迅速移出冷凍管，擦干并把它轉(zhuǎn)移到無菌環(huán)境下，此時平衡后的培養(yǎng)液正有待于細胞的移入。用70%的乙醇清洗冷凍管，然后擦干并移走多余的。
5. 注意解凍管中細胞的顏色。理想情況下，解凍管中細胞的顏色是粉紅的。如果顏色不是粉紅的，種植細胞并記下顏色。如果培養(yǎng)不成功，詢問一下您的技術(shù)專家，并把細胞的真實顏色告訴專家。
注示：
——如果每個冷凍管要解凍，一次解凍一個，并且使其他冷凍管放在液氮中。
——冷凍保存的細胞很嬌嫩。解凍后以zui少的撫摸盡可能快的速度把細胞放回培養(yǎng)液中。
——當處理冷凍細胞時，戴上眼罩。快速的溫度變化可能導(dǎo)致液氮的飛濺。
——從防冷凍的混合液中移走細胞，離心過濾法不宜采用。離心過濾的損害性比DMSO殘留在培養(yǎng)液中更大。
——直接在玻璃滑板、格子板或多空離心板上解凍細胞是不合適的。如果zui初從冷凍保存中移植入T-25試管中，*的性能才能體現(xiàn)。如果更深一步了解，請遵循上述提供的細胞培養(yǎng)的方法。
種植貼壁細胞株
1． 打開瓶蓋，小心不要用手指碰到內(nèi)部的危險物。
2． 用1000μl微型移液管定到800μl，把管尖插入冷凍管中，用移液管輕緩而平穩(wěn)地上下移液不超過5次以此來使細胞懸浮。決不要使細胞懸浮太快，把管尖插入到近底部以免產(chǎn)生氣泡。
3． 把細胞等量的分送到預(yù)備好的試劑瓶中。如果準備的是四個T-25，把微型移液管調(diào)到250μl進行分送；如果準備的是八個T-25試劑瓶，把微型移液管調(diào)到125μl進行分送。
4． 蓋上瓶塞，輕搖小管使細胞在管中均勻分布。如果有必要，擰松瓶塞允許氣體交換。
5． 把培養(yǎng)管放回5%的37℃的培養(yǎng)箱中。平放在架子上，使細胞能zui大程度地著壁。細胞將附著在試劑瓶表面的底部生長。
種植以后
細胞不能承受快速的溫度變化，也不能在營養(yǎng)缺乏的培養(yǎng)基上生長。用已經(jīng)溫化的新鮮生長培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞將會防止?jié)撛诘膯栴}（切記：僅溫化所需量的培養(yǎng)液）檢查和喂養(yǎng)下表中的細胞，即使在周末和假期。
1． 種植細胞的當天，換一下生長培養(yǎng)液（移走殘留物和不貼壁細胞）然后當每天檢查它們時，每隔一天換一次培養(yǎng)液。
2． 成功的重新利用培養(yǎng)液將會展現(xiàn)以下特點：
a.細胞質(zhì)是清晰的，無顆粒的
b.兩天后呈現(xiàn)出大量有絲分裂的形體。
3． 當細胞變得更加融合時，用更多培養(yǎng)液喂細胞，用下表作為參考：
如果細胞是 然后喂它們
<25%融合 1ml/5cm2
25-45%融合 1.5ml/5cm2
>45%融合 2ml/5cm2
4.在達到70-90%融合以前，繼續(xù)喂養(yǎng)，如果特殊細胞株允許過度融合（比如說上皮細胞）并且在融合狀態(tài)下超過兩天，那么它們很難承受不可逆的接觸抑制，可以從燒杯中分離開來，很難使其受*的作用。

增殖貼壁細胞株
1． 在貨運的過程中仔細檢查一下培養(yǎng)基有沒有短缺的信號。檢查相對細胞密度，估計百分融合度。根據(jù)收條，培養(yǎng)基應(yīng)該是30-100%的融合。有一些細胞分離是正常的。如果細胞看起來嚴重請立刻詢問您的技術(shù)專家。
2． 用70%的乙醇或異丙醇清洗細胞培養(yǎng)試劑瓶或多孔板的外表面。
3． 把密封試劑瓶或多孔板放入37℃、5%CO2的環(huán)境下3-4個小時，使之達到適宜的溫度。
4． 在無菌培養(yǎng)箱中把適量的生長培養(yǎng)液溫育到37℃。溫育整個瓶子能縮短培養(yǎng)液的壽命。不要在流動的熱水下或難以控制的熱源下溫育培養(yǎng)基。決不要用微波傳送熱。
5． 無菌條件下，小心打開細胞培養(yǎng)試劑瓶或多孔板，移走培養(yǎng)液，換上溫暖新鮮的培養(yǎng)液。無菌條件下移走瓶頸或瓶蓋上的培養(yǎng)液，以免有細菌污染。
6． 如果試劑瓶上裝的是不透氣的瓶蓋，擰松瓶蓋，把試劑瓶放回到5%CO2和37℃濕潤的培養(yǎng)箱中，至少培養(yǎng)24小時。
次培養(yǎng)貼壁細胞株
次培養(yǎng)試劑的貯存信息
1． 次培養(yǎng)試劑經(jīng)過過濾消毒，在從Cambrex發(fā)送中心發(fā)送以前，一直貯存在-20℃的條件下。
2． 在運輸過程中，次培養(yǎng)試劑可能會解凍。它們可能需要再次冷凍。
3． 再次解凍和冷凍后，次培養(yǎng)試劑貯存在-20℃的條件下可長達一年。
4． 為保持Trypsin/EDTA冷凍后新鮮性和活性，你可以把它分成部分裝入無菌離心管中再次冷凍到-20℃。Trypsin/EDTA可冷凍貯存一年。
5． HEPES-BSS和*中性溶液貯存在4℃條件下，保質(zhì)期一個月。
96孔培養(yǎng)板上的次培養(yǎng)
概要
正常人體細胞培養(yǎng)瓶要經(jīng)過*化作用和隨后的*抑制劑的處理。細胞離心后，懸浮在生長培養(yǎng)液中，同時可記數(shù)。既定數(shù)目的細胞移入96孔無菌組織培養(yǎng)板上。培養(yǎng)板在37℃、5%CO2和濕潤的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-3天，這樣細胞就可以貼壁和生長。種植密度根據(jù)你的實驗要求而定。多孔板上的細胞密度為10,000細胞/cm2理想。如要了解你正用的細胞株的特別信息，請參看細胞培養(yǎng)說明單。
冷凍保存的方法
冷凍保存可能會損害細胞的質(zhì)量和性能。細胞經(jīng)過冷凍保存后，其性能不能保證。這些說明不適用于CloneticsTM肝細胞或神經(jīng)始祖細胞。
方法：
1． 用分辨率為0.2的微量過濾細胞培養(yǎng)器無菌過濾冷凍培養(yǎng)液。
2． 把細胞收集起來并旋轉(zhuǎn)倒置。
3． 在大約500,000-2,000,000細胞/ml的冷凍液中再次使細胞懸浮。動作要迅速。一旦置于DMSO下，細胞就會變得脆弱。
4． 用移液管等分成1ml裝入到冷凍管或瓶中。
5． 用Styrofoam®或丙醇冷凍罐使等分部分隔離。
6． 在-70℃條件下貯存細胞一夜。
7． 在12-24小時內(nèi)，可放在LN2（-200℃）中長期保存。在-70℃下延長保存會損害細胞。
以下是冷凍保存液：
通道細胞培養(yǎng)液的選擇
通道細胞培養(yǎng)液都是非血清培養(yǎng)液，適合于通道細胞的增殖?；九囵B(yǎng)基的每一種成分和每一種生長補充物都有Cambrex及其小組經(jīng)過認真地測定，使之zui適于生長。考慮到不同的性能要求和制作的靈活性，目前Cambrex提供了兩種適合于通道細胞生長的培養(yǎng)液。選擇培養(yǎng)基時，先看看特定的培養(yǎng)液說明書或者請教一下你的技術(shù)專家。
以下是培養(yǎng)液產(chǎn)品：
內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液的選擇
內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液都是低血清培養(yǎng)液，適合于內(nèi)皮細胞的增殖?；九囵B(yǎng)基的每一種成分和每一種生長補充物都有Cambrex及其小組經(jīng)過認真地測定，使之zui適于生長?？紤]到不同的性能要求和制作的靈活性，目前Cambrex提供了四種適合于內(nèi)皮細胞生長的CloneticsTM培養(yǎng)液。選擇培養(yǎng)基時，先看看特定的培養(yǎng)液說明書或者請教一下你的技術(shù)專家。
以下是培養(yǎng)液產(chǎn)品：
纖維原細胞培養(yǎng)液的選擇
纖維原細胞培養(yǎng)液適合于纖維原細胞的增殖。基本培養(yǎng)基的每一種成分和每一種生長補充物都有Cambrex及其小組經(jīng)過認真地測定，使之zui適于生長?？紤]到不同的性能要求和制作的靈活性，目前Cambrex提供了兩種適合于纖維原細胞生長的培養(yǎng)液。選擇培養(yǎng)基時，先看看特定的培養(yǎng)液說明書或者請教一下你的技術(shù)專家。
以下是培養(yǎng)液產(chǎn)品：
以下是肝細胞培養(yǎng)液產(chǎn)品：
角化細胞培養(yǎng)液的選擇
角化細胞培養(yǎng)液適合于角化細胞的增殖?；九囵B(yǎng)基的每一種成分和每一種生長補充物都有Cambrex及其小組經(jīng)過認真地測定，使之zui適于生長?？紤]到不同的性能要求和制作的靈活性，目前Cambrex提供了三種適合于角化細胞生長的培養(yǎng)液。選擇培養(yǎng)基時，先看看特定的培養(yǎng)液說明書或者請教一下你的技術(shù)專家。
以下是培養(yǎng)液產(chǎn)品：
以下是淋巴細胞生長培養(yǎng)液（非血清）產(chǎn)品：
黑素細胞培養(yǎng)液的選擇
黑素細胞培養(yǎng)液適合于黑素細胞的增殖?；九囵B(yǎng)基的每一種成分和每一種生長補充物都有Cambrex及其小組經(jīng)過認真地測定，使之zui適于生長?？紤]到不同的性能要求和制作的靈活性，目前Cambrex提供了兩種適合于黑素細胞生長的培養(yǎng)液。選擇培養(yǎng)基時，先看看特定的培養(yǎng)液說明書或者請教一下你的技術(shù)專家。
以下是培養(yǎng)液產(chǎn)品：
以下是神經(jīng)細胞培養(yǎng)液（低血清）產(chǎn)品：
以下是前列腺上皮細胞培養(yǎng)液（非血清）產(chǎn)品：
以下是腎細胞培養(yǎng)液（低血清）產(chǎn)品：
以下是骨骼細胞培養(yǎng)液產(chǎn)品：
以下是骨骼肌細胞培養(yǎng)液（非血清）產(chǎn)品：
平滑肌細胞培養(yǎng)液的選擇
平滑肌細胞培養(yǎng)液適合于平滑肌細胞的增殖?；九囵B(yǎng)基的每一種成分和每一種生長補充物都有Cambrex及其小組經(jīng)過認真地測定，使之zui適于生長?？紤]到不同的性能要求和制作的靈活性，目前Cambrex提供了兩種適合于平滑肌細胞生長的培養(yǎng)液。選擇培養(yǎng)基時，先看看特定的培養(yǎng)液說明書或者請教一下你的技術(shù)專家。
以下是培養(yǎng)液產(chǎn)品：
以下是基質(zhì)細胞培養(yǎng)液（低血清）產(chǎn)品：
以下方法是針對25cm2試管來說的。對大小不同的試管，可相應(yīng)得調(diào)節(jié)溶液的體積。
準備
準備次培養(yǎng)的*個試劑瓶
1． 當細胞達到70-90%融合并且在整個試劑瓶中包含大量有絲分裂形體后，次培養(yǎng)它們。
2． 次培養(yǎng)25cm2細胞
a.解凍2ml*/EDTA溶液并且使之達到室溫
b.使5ml的HEPES Buffeced Saline Solution(HEPES-BSS)溶液達到室溫
c.使4ml*中性溶液(TNS)達到室溫。
3． 從4℃的冰柜中取出生長培養(yǎng)液，使之達到室溫。
4． 準備新的培養(yǎng)器皿
a) 準備5-10T-25試劑瓶。所需試劑瓶的數(shù)目依據(jù)混合度和總產(chǎn)量而定。用大的試劑瓶可節(jié)省塑料器皿和接下來花在次培養(yǎng)上的時間。小的試劑瓶可以減少失去你培養(yǎng)液中有效成分的機率。
b) 像以前一樣，在每個試劑瓶上貼上標簽，標簽上標明代數(shù)、菌株數(shù)、細胞類型和日期。
c) 在無菌環(huán)境下，小心打開瓶口，按每5cm²表面加1ml生長培養(yǎng)液的標準，把生長培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)器皿中。
d) 如果沒用可排氣的瓶蓋，擰松瓶蓋。把新的培養(yǎng)器皿放到盛有5%CO237℃潮濕培養(yǎng)箱中，并使器皿置于此環(huán)境下至少30分鐘。
一次性培養(yǎng)一個試劑瓶，遵循化草案（在這個過程中以后解釋），所有試劑瓶中的細胞都應(yīng)在*個試劑瓶后被次培養(yǎng)。這種草案依據(jù)合適的細胞計數(shù)，細胞存活率和細胞密度而定。
在無菌環(huán)境下
（以T-25試劑瓶為例，對其它試劑瓶增加其相應(yīng)溶液體積就行）
1. 從一個培養(yǎng)器皿中吸收培養(yǎng)液
2. 用5ml室溫下的HEPES-BSS溶液漂洗細胞。不要忘記這一步，培養(yǎng)液中包含有能中和*的復(fù)雜蛋白質(zhì)。
3. 從試劑瓶中吸入HEPES-BSS溶液。
4. 用2ml*/EDTA溶液覆蓋細胞。
5. 擰緊瓶蓋，并且在顯微鏡下觀察試劑瓶中的細胞。
6. 顯微鏡下繼續(xù)檢查細胞層。
a. 將近90%的細胞被收集后，停止*作用。
注：收集的細胞呈球形的，有光滑的邊緣，并且能折射的或光亮的，如果細胞仍然粘附瓶壁，他們需要更長時間的*化，根據(jù)不同的細胞株，整個過程需要花費2-6分鐘。
b. 此時，用手背輕敲試劑瓶使大量細胞從培養(yǎng)基表面釋放出來，如果僅有一些細胞分離，你的*化不足，等30秒后再次輕敲。如果細胞仍然不分離，此后每等30秒后，再次輕敲。
注：不要劇烈地叩擊以期望所有的細胞都從培養(yǎng)基表面脫離。這種行為將會損害細胞。
7. 細胞脫離后，用4ml室溫下的*中性溶液中和試劑瓶中的*。如果大量細胞沒有在幾分鐘內(nèi)分離，*要么沒有進行足夠的溫化或沒有分離這些細胞的足夠活性，像上述那樣收集培養(yǎng)器皿，要么用新鮮溫暖的*/EDTA溶液再次*化，要么用*中性溶液漂洗，然后把新鮮溫暖的培養(yǎng)液加入到培養(yǎng)器皿中，接著把試劑瓶放回培養(yǎng)箱，直到新鮮的*化作用的試劑可用為止。
8. 快速把分離的細胞轉(zhuǎn)移到15ml無菌離心管中。
9. 用zui后2mlHEPES-BSS溶液漂洗試劑瓶，來收集殘余細胞，并把這些漂洗液放入離心管中。
10. 在顯微鏡下檢查一下已經(jīng)被收獲后的試劑瓶，如果試劑瓶中殘留的細胞數(shù)目不到5%，細胞收獲是成功的。
11. 數(shù)一下細胞并計算一下每毫升細胞數(shù)和整個試劑瓶中的細胞數(shù)。
12. 把浮在表面的東西加入到組織培養(yǎng)瓶中，輕輕地混合并把其放入到培養(yǎng)箱中。
你可以用下述步驟次培養(yǎng)細胞，你可以用臺盼藍估計細胞產(chǎn)量和存活力。
按照以下步驟：
1. 用血球計或細胞計數(shù)器數(shù)細胞，計算細胞總數(shù)，記錄一下你的細胞數(shù)量以備后用。
為了獲得zui大的性，懸浮細胞液應(yīng)包含250.000—1.000.000細胞/毫升。
2. 如果必要，用HEPES-BSS稀釋懸浮液而得到需要的細胞數(shù)/毫升，再次數(shù)一下細胞。
3. 用臺盼藍估計細胞存活力。
4. 用以下等式?jīng)Q定總的細胞存活數(shù)。
=總的細胞數(shù)*百分存活率
5. 用以下等式?jīng)Q定接種試劑瓶中細胞總數(shù)，需要的試劑瓶中的數(shù)目依據(jù)細胞產(chǎn)量和種植密度而定。大的試劑瓶可節(jié)省塑料器皿和接下來次培養(yǎng)的時間。如果污染發(fā)生小的試劑瓶可減少失去培養(yǎng)液中有效成分的機率。建議種植密度為2500細胞/cm²，3500/cm²或5000/cm²
6. 用下面等式計算出你要種植的細胞懸浮液的體積。
7. 在每個試劑瓶中貼上標簽，標明代時，分開日期、細胞株和日期。
8. 小心打開培養(yǎng)瓶，按每5 cm²表面加1ml生長培養(yǎng)液的標準，把生長培養(yǎng)液加入到新的培養(yǎng)器皿中。
9. 用5ml移液管使稀釋細胞混合，確保懸浮液均衡，把上述計算過的懸浮液的體積分發(fā)到預(yù)備好的次培養(yǎng)試劑瓶中。
10. 分發(fā)細胞后，輕輕搖動試劑瓶而促使細胞均衡分布。
11. 如果不用可透氣的瓶蓋，擰松瓶蓋，把新的培養(yǎng)器皿放入盛有5% CO2的37℃的有濕度的培養(yǎng)箱中
要求的材料：
1. 在70%-90%融合下的正常增殖人體細胞用的T-25試劑瓶
2. 96孔平底組織培養(yǎng)板。
3. 盛有5% CO2/95%空氣的37℃有濕度的培養(yǎng)箱。
4. 層流板或其他無菌環(huán)境。
5. 可調(diào)節(jié)的多孔道移液管（8或12孔）或重復(fù)使用的移液管。
6. 用多孔道移液管使將用的貯存箱無菌。
步驟：
1. 為準備次培養(yǎng)和進行次培養(yǎng)，請遵循以下步驟。
2. 因為細胞數(shù)/毫升的計數(shù)是每毫升，所以細胞在植入96孔板之前，細胞濃度必須增加4倍，當制作細胞懸浮液時，用生長培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度。
3. 把稀釋后的細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到無菌貯藏瓶中。用裝有無菌移液尖的多孔（8或12孔）移液管，把250μl的稀釋細胞培養(yǎng)液加入到標有96孔平底組織培養(yǎng)板的每一個孔中。每次分發(fā)植入細胞時，都要使細胞再次懸浮以確保細胞在瓶中分布均衡，使細胞再次懸浮的辦法是用移液管在瓶中上下移動幾次。
4. 在37℃/5% CO2的培養(yǎng)箱中，蓋上培養(yǎng)板并培養(yǎng)1-3天。（培養(yǎng)期超過三天通常不被采用，因為板孔邊緣培養(yǎng)液的蒸發(fā)）
注：在生物測定中，在用96孔板培養(yǎng)以前，在顯微鏡下觀察有絲分裂的存在，以確保細胞恢復(fù)了活性生長。
提高細胞產(chǎn)量和存活力
幾種因素或因素的綜合使細胞產(chǎn)量和存活力降低，如果不滿意細胞產(chǎn)量或存活力，用以下信息增加日后培養(yǎng)的成功率。
提高細胞產(chǎn)量
如果細胞產(chǎn)量低（少于50%），用下表找到原因和可能的解決辦法。運用合適的方法次培養(yǎng)多個試劑瓶。
解凍CD34+和前體細胞的步驟：
1. 溫化含有10%FBS或1%BSA的培養(yǎng)液，對單核細胞來說，Dnase也能被加進去。
2. 在37℃水浴中快速解凍冷凍細胞，用70%異丙醇擦洗試管的外部。
3. 無菌條件下把2mlzui大量的細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到50ml圓錐形的試管中。對于一百萬個細胞或更少用15ml圓錐形小管。
4. 用1ml培養(yǎng)液漂洗小管，當輕輕搖動試管（約1分鐘）的過程中，把懸浮液逐滴加入細胞中。
5. 每加入一次培養(yǎng)液，都要輕輕旋轉(zhuǎn)一會兒（約3分鐘），慢慢地逐滴加入直到是5ml培養(yǎng)液于細胞中。
6. 每加入一次培養(yǎng)液，都要輕輕旋轉(zhuǎn)一下（約5-10分鐘），慢慢地逐滴加入1-2ml培養(yǎng)液使試管充滿。
7. 在室溫下，以zg的情況使細胞懸浮液離心15分鐘。
8. 用移液管小心移去大多數(shù)洗液，留下幾毫升，這樣細胞顆粒不會被干擾，輕輕搖動使培養(yǎng)液的細胞顆粒懸浮。如果你用50ml試管，把細胞轉(zhuǎn)移到15ml圓錐形管中，要用5ml培養(yǎng)液漂洗50ml試管，慢慢地把5ml沖洗培養(yǎng)液加入到細胞懸浮液中，同時輕搖。
9. 慢慢地加入1-2ml體積培養(yǎng)液使試管充滿，同時加入以后都要輕搖一下。
10. 室溫情況下，離心細胞懸浮液15分鐘。
11. 用移液管小心地移走洗液，僅留2ml洗液，輕輕地再次使裝在2ml培養(yǎng)液的細胞顆粒懸浮并計數(shù)，如果細胞數(shù)目低于預(yù)計的，在8級更高速度下，離心保留下來的洗液，計數(shù)并且在必要的情況下合并。
12. 在37℃和5% CO2下使細胞休息1小時，再次數(shù)一下細胞，細胞有待于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
CloneticsTM培養(yǎng)基系統(tǒng)
培養(yǎng)基為正常人體細胞的特殊類型的*化生長而制作的?？梢韵荣I無補充物的基本培養(yǎng)基，再加入補充的生長培養(yǎng)基，或方便地購買包裝好的Bulletkits®試劑，它能允許用戶控制補充液類型和濃度。每種培養(yǎng)基經(jīng)檢驗都能支持預(yù)定正常人體細胞的生長。每塊培養(yǎng)基的性能都經(jīng)過生化和無菌檢驗，對于所要的培養(yǎng)基產(chǎn)品，都有分析合格證書。
基本培養(yǎng)基
基本培養(yǎng)基適用于正常人體細胞特別類型培養(yǎng)。基本培養(yǎng)基不包含細胞增殖必要生長因子。生長因子必須被加入以增強效能和細胞增殖。許多Clonetics培養(yǎng)基從Richard Ham實驗室中制造出來的。該實驗室屬于Colorado大學的分子與細胞發(fā)育生物學系。新的和改良的人體細胞培養(yǎng)基也是在我們的培養(yǎng)基研制室有規(guī)律的制造出來。優(yōu)化制作使得正常人體細胞株在更廣泛的研究成為可能。這幾年培養(yǎng)基的發(fā)展對你自己研究更有利。
*培養(yǎng)基
*培養(yǎng)基補充有生長培養(yǎng)基，并且包含所有的生長因子和有助于正常人體特殊細胞株增殖的必要補充物。沒介定的補充物在可能情況下可以避免，當有必要時可以zui低的標準用，所有生長培養(yǎng)基的基本制作包括有抗菌劑，訂購抗菌劑的培養(yǎng)基可作特殊訂購。
Bulletkits
Bulletkits提供了培養(yǎng)基的zui后制作程序的靈活性，而是增加了保存期限，每個Bulletkit包含基本培養(yǎng)基和預(yù)先測定的單獨用的生長因子和抗菌劑，以此來制成你選擇的補充生長培養(yǎng)基。
特定培養(yǎng)基
Cambrex的正常培養(yǎng)基制作實驗室允許你選擇的培養(yǎng)基成分的濃度改變。特定培養(yǎng)基牽涉到庫存培養(yǎng)液的再制作，培養(yǎng)液包含氨基酸、維生素、微量礦物、鹽類、糖類和對細胞代謝必需的其他相對穩(wěn)定的生化物質(zhì)。根據(jù)你的要求，特定生長因子和你自己需要的額外成分也能被加入制成培養(yǎng)基。Cambrex也研制出了非血清或低血清的培養(yǎng)基以備你選擇的人體細胞株生長。請咨詢。
BEGM®Bulletkit®
基本培養(yǎng)基以MCDB-151和LHC-9制作的改動為基礎(chǔ)。
支氣管上皮細胞的生長的培養(yǎng)液包含抗菌劑SAGMTM Bulletkit
用CCMD-161制作方法，基本培養(yǎng)被研制出來。
小的通道上皮細胞和支氣管的上皮細胞的無抗菌劑培養(yǎng)液的生長。
EGMTM和EGM Bulletkit®
基本培養(yǎng)基以有少許改動的MCDB-131的制作為基礎(chǔ)；以低血清的環(huán)境下制成正常人體內(nèi)皮細胞。
EGM是補充生長培養(yǎng)液，包括牛腦提取液的粘附部分。
EGM Bulletkit包括有附加成分的基本培養(yǎng)基和分升冷凍包裝的生長因子。
zui終血清濃度是2%
EGN可用來培養(yǎng)所有的除微血管、冠狀動脈和臍動脈以外的Clonetics內(nèi)皮細胞。
EGM-MV Bulletkit
適合微血管和冠狀動脈內(nèi)皮細胞
像EGM一樣，也是基本培養(yǎng)基
zui終血清濃度為5%
EGM-MV可用來培養(yǎng)除HMVEC-L之外的所有的Clonetics內(nèi)皮細胞
EGM-2 Bulletkit
提純后的基本培養(yǎng)基和生長因子
不包含BBE
zui終血清濃度為2%
此EGM能提高細胞的增殖
EGM可用來培養(yǎng)除微血管和冠狀動脈之外的所有Clonetics內(nèi)皮細胞
EGM-I-MV Bulletkit
適合增強肺微血管內(nèi)皮細胞的生長
不包含BBE
zui終血清濃度增加到5%
EGM-I-MV能用來種植所有的Clonetics內(nèi)皮細胞
FGM®Bulletkit®
依據(jù)MCDB-202的配方設(shè)計的基本培養(yǎng)基
FGM是特定的不包含血清的培養(yǎng)基系統(tǒng)
FGM-2 Bulletkit
依據(jù)MCDB-202的配方設(shè)計的基本培養(yǎng)基
包含F(xiàn)BS的單個成分，zui終血清濃度為2%
KGM®和KGM Bulletkit®
依據(jù)有改動的MCDB-153配方設(shè)計的基本培養(yǎng)基，適合于在非血清環(huán)境下Clonetics正常人體角化細胞的生長。
KGM包括補充培養(yǎng)基和牛垂體提純物的粘附部分
KGM Bulletkit包括所有補充成分的基本培養(yǎng)基和分開冷凍保存的生長因子
KGM培養(yǎng)所有CloneticsTM角化細胞
BGM-2 Bulletkit®
依據(jù)有改動的MCDB-153的配方設(shè)計的基本培養(yǎng)基，用來培養(yǎng)正常新生兒的黑素細胞
非血清
牛垂體提取液（BPE），7.5mg/ml
基本鈣濃度降到0.5ml
BGM-3 Bulletkit
依據(jù)有改動的MCDB-153的配方設(shè)計的基本培養(yǎng)基，用來提高新生兒和成人黑素細胞的生長率
zui終血清濃度為0.5‰
zui終基本鈣濃度為0.5ml
MGM-3用來培養(yǎng)所有的黑素細胞
SmGM-2 Bulletkit®
依據(jù)有改動的MCDB-133的配方設(shè)計的基本培養(yǎng)基，適合在低血清下培養(yǎng)平滑肌細胞
SmGM-2 Bulletkit更有利于細胞形態(tài)和增殖
*被移走后，所有生長因子re-titered，同時，加入胰島素
zui終血清濃度為5%
SMGM-2可培養(yǎng)所有平滑肌細胞
SmGM-3 Bulletkit
該培養(yǎng)基在平滑肌細胞分離中選擇性更強
降低分化細胞的同時，進一步增強增殖
對基本培養(yǎng)基是一種調(diào)節(jié)
更特定的培養(yǎng)基，zui終血清濃度為0.5%
FBS:Fetal Bovine Serum,胎牛血清；
Defined FBS：特級胎牛血清，經(jīng)過40納米過濾的*胎牛血清。的促細胞生長作用及產(chǎn)品穩(wěn)定性。內(nèi)毒素含量<10EU/ml，血紅蛋白含量<10mg/dl。
Characterized FBS：優(yōu)等胎牛血清，經(jīng)過三次100納米過濾。內(nèi)毒素含量<25EU/ml，血紅蛋白含量<25mg/dl。
Standard FBS：標準胎牛血清，經(jīng)三次100納米過濾的高品質(zhì)胎牛血清。低內(nèi)毒素和血紅蛋白含量。優(yōu)良的性能價格比。
Certified New Zealand FBS：新西蘭胎牛血清，原料血產(chǎn)于新西蘭。由HyClone公司加工生產(chǎn)，*符合HyClone公司質(zhì)量檢測標準。內(nèi)毒素含量<20EU/ml，血紅蛋白含量<25mg/dl。
Charcoal Dextran Treated FBS：活性炭/葡聚糖處理的胎牛血清，經(jīng)過活性炭/葡聚糖處理，使各種激素含量大大降低。內(nèi)毒素含量<10EU/ml，血紅蛋白含量<20mg/dl。
Dialyzed FBS：透析型胎牛血清，以10000分子量為分離點的過濾系統(tǒng)過濾，使次黃嘌呤和胸腺核苷降低到正常測定方法檢測不到的超低含量。內(nèi)毒素含量<10EU/ml，血紅蛋白含量<10mg/dl。
Low IgG FBS：天然低IgG胎牛血清，由天然發(fā)生（非經(jīng)化學方法清除）的低IgG含量血清收集起來統(tǒng)一加工而成。IgG含量低于20mg/ml尤其適合于單克隆抗體的生產(chǎn)。經(jīng)40納米過濾。內(nèi)毒素含量<25EU/ml，血紅蛋白含量<25mg/dl。
ES Cell Screened Defined FBS：胚胎干細胞特級胎牛血清，專為胚胎干細胞培養(yǎng)而篩選的zui高品質(zhì)的特級胎牛血清。經(jīng)40納米過濾。內(nèi)毒素含量<10EU/ml，血紅蛋白含量<10mg/dl。
Insect Cell Screened Defined FBS：昆蟲細胞特級胎牛血清，于SF-9等昆蟲細胞培養(yǎng)而優(yōu)選的zui高品質(zhì)的特級胎牛血清。尤其適用于桿狀病毒表達載體系統(tǒng)進行重組蛋白生產(chǎn)。經(jīng)40納米過濾。內(nèi)毒素含量<10EU/ml，血紅蛋白含量<10mg/dl。